Modificazioni del pre-mRNA eucariotico

Questa fase consiste in diverse modificazioni che deve subire il pre-mRNA per essere trasformato nella sua forma matura, l’mRNA.

Come per la trascrizione, anche queste modificazioni avvengono nel nucleo.

1. Aggiunta del cappuccio al 5′

Quando l’RNA polimerasi II ha prodotto almeno 25 nucleotidi di RNA, l’estremità 5′ della molecola viene modificata tramite l’aggiunta di un cappuccio, ovvero un nucleotide guaninico modificato.

Questa modificazione richiede tre enzimi in successione:

Fosfatasi → rimozione di un fosfato dall’estremità 5′
Guanil-trasferasi → aggiunta di un GMP (guanosina monofosfato) in legame inverso (5′ a 5′ e non 5′ a 3′)
Metil-trasferasi → aggiunta di un metile alla guanosina

Tutti e tre gli enzimi si legano alla coda fosforilata della polimerasi II, dunque sono già pronti ad agire non appena l’estremità 5′ emerge dalla polimerasi.

La formazione del cappuccio al 5‘ permette alla cellula si distinguere gli mRNA dagli altri tipi di RNA sintetizzati dalle RNA polimerasi I e III (questi due enzimi non presentano il CTD, quindi non possono aggiungere il cappuccio ai loro RNA). Inoltre, il cappuccio è importante per una corretta esportazione, in quanto nel nucleo lega al complesso proteico CBC (cap-binding complex), e traduzione dell’mRNA nel citoplasma.

2. Splicing dell’RNA

Durante la trascrizione vengono trascritti anche gli introni (sequenze non codificanti) ed è quindi necessario rimuoverli prima della traduzione dell’mRNA. Questo avviene grazie allo splicing del pre-mRNA.

Lo splicing può anche avvenire in modi diversi sullo stesso gene, per poter produrre mRNA differenti e quindi proteine diverse.

Questo processo consiste in due reazioni di transesterificazione (trasferimento di fosfato), con idrolisi di ATP, che vanno ad unire due esoni, rimuovendo l’introne come un “cappio”.

Perché avvenga in maniera corretta, è importante che il macchinario di splicing (spliceosoma) riconosca tre porzioni del pre-mRNA: il sito di splicing 5′, il sito di splicing 3′ e il punto di ramificazione della sequenza intronica (A) che permette la formazione del cappio. Queste brevi sequenze sono simili in tutti gli introni.

Ad essere coinvolti in questo processo, sono cinque molecole specializzate di RNA (snRNA, piccoli RNA nucleari) complessati con almeno sette subunità proteiche, diventando snRNP. Gli snRNP sono in grado di riconoscere e legarsi a queste sequenze e insieme formano il nucleo dello spliceosoma.

L’interazione RNA-RNA comporta la formazione di un sito attivo catalitico che permette le due reazioni di transesterificazione:

Due dei cinque snRNP formano una struttura tridimensionale di RNA che permette il congiungimento del sito di splicing 5′ al punto di ramificazione (A), dove avverrà il primo trasferimento del gruppo fosfato
A questo punto, la presenza di un terzo snRNP, permette il congiungimento dei due esoni per mezzo della seconda reazione.

Successivamente, gli snRNP rimangono legati al cappio che viene rilasciato e sempre per idrolisi di ATP, gli snRNA tornano alla loro configurazione originale e pronti per la prossima reazione di splicing.

A questo punto, lo spliceosoma lega delle proteine (note come complesso della giunzione degli esoni) vicino alla posizione dove stava l’introne, così da segnare il sito di splicing avvenuto correttamente.

3. Poliadenilazione al 3′

Durante la fine della trascrizione, l’RNA polimerasi II trascrive l’estremità 3′ che contiene segnali riconosciuti da proteine note come CstF (fattore di stimolazione del taglio F) e CPSF (fattore di specificità del taglio e della poliadenilazione) che si trovano già pronte sulla coda della polimerasi II.

L’enzima coinvolto è la poli-A polimerasi (PAP) che, a differenza della polimerasi II, non ha bisogno di uno stampo ma crea la coda di poli-A con l’aiuto di specifiche proteine che legano il poli-A, il quale ruolo è quello di determinare la lunghezza finale della coda stessa.

In questa fase, l’RNA viene tagliato e l’enzima (PAP) aggiunge, uno alla volta, 200 nucleotidi A all’estremità 3′. Dopodiché, alcune proteine che legano il poli-A si staccano dall’mRNA, mentre altre rimangono attaccate per poter guidare l’mRNA dal nucleo al citosol, fino al ribosoma.