La tecnica consiste nella colorazione delle endospore, tipiche di bacilli Gram+ e Clostridi.

La spora è una formata, partendo dall’interno, dal core, dalla membrana citoplasmatica, dalla parete cellulare (che comprende una specializzazione del peptidoglicano, detta corteccia) e dalla tunica sporale.

Con in termine endospora si intende la spora prodotta all’interno della cellula. Viceversa, quando è prodotta all’esterno, è detta esospora.

Il batterio, quando le condizioni ambientali diventano inadatte alla replicazione (temperature e pH estremi, mancanza di nutrienti, etc…), entra in uno stato quiescente. Quindi diventa spora e blocca il metabolismo per poter sopravvivere, rimanendo in questo stato finché le condizioni non torneranno favorevoli.

Alcuni batteri diventano spore attraverso un processo a più stadi, la sporulazione. La membrana citoplasmatica della cellula in stato vegetativo (stadio 0) entra in stato quiescente (stadio I) e si invagina dividendola in due porzioni, una più grande e una più piccola, nella quale si svilupperà la spora (stadio II). La spora viene quindi inglobata dalla membrana citoplasmatica della porzione più grande (stadio III). Dopodiché la spora comincia a perdere acqua e si forma la corteccia (stadio IV-VI). A questo punto la spora è pronta per essere liberata dalla cellula madre (stadio VII).

Non appena le condizioni tornano ad essere favorevoli, nell’arco di un’ora la spora torna allo stato vegetativo attraverso il processo di germinazione.

I coloranti impiegati sono il verde malachite (specifico le endospore) e la safranina (colorante di contrasto che agisce solo sulle cellule madri). Per facilitare l’entrata del verde malachite nella cellula, viene sfruttato il vapore bollente.

Metodica

1. Porre su una piastra riscaldante un becker con dell’acqua e portare a bollore;
2. Depositare del campione sul vetrino portaoggetti e fissare su fiamma;
3. Posizionare il vetrino sopra il becker (così da essere esposto al vapore bollente), distribuire il verde malachite e lasciare agire 3-5 minuti, senza lasciar seccare;
4. Togliere il vetrino dal vapore e lavare con acqua distillata;
5. Distribuire la safranina e lasciare agire per 2 minuti;
6. Lavare con acqua distillata.

A questo punto, osservando il vetrino al microscopio, si potranno osservare le endospore (verdi) all’interno dei batteri (rosa).